广州健仑生物科技有限公司

　

一、适用范围

适用于生活饮用水及其水源水中卫生指标菌与致病菌的日常监测以及应急检测需要。

二、实验前的准备工作及操作中的注意事项

1 开展微生物快速检测所需的基本条件

1.1 一间通风良好、面积不需要很大的独立房间，房间里备有紫外线消毒灯，洗手盆，实验台。应急检测时，临时性的房间应注意工作环境的的消毒(如采用84消毒液消毒等)，并备好酒精灯。

1.2 一台高压锅或红外线消毒柜(家用消毒碗柜也可。)应急检测时，应备好消毒液，含氯消毒液的浓度在250ppm时，器皿消毒应保持5分钟以上。

1.3 一台小型恒温培养箱；

1.4 有条件时，配备一台普通冰箱，用于存放样品；

1.5 水质微生物采样检测箱，箱内备有采样用具与实验用的一些工具和器皿；

1.6 检测用试纸与试剂盒。

2 移液器的消毒

2.1 移液器管头的消毒：将管头放入锡箔袋或用锡箔纸包好，放入民用红外线消毒柜中消毒；或将管头放入消毒液中浸泡，取用时注意甩干消毒液并用无菌生理盐水冲洗三次。

3. 无菌操作和注意事项

3.1点燃酒精灯，营造局部无菌环境。取样和加样时尽量靠近酒精灯操作。能用火焰消毒的操作工具如镊子、剪子、长柄勺、小刀等应在酒精灯上消毒后使用。

3.2 用75%酒精棉球将手抹擦消毒。

3.3 废弃物及时按照生物安全废弃物处理原则进行处理 。

三、生活饮用水微生物常规指标及限值

根据国家生活饮用水卫生标准(GB 5749—2006)，常规的微生物指标及限值如下：

指 标	限 值
菌落总数(CFU/mL)	100
总大肠菌群(MPN/100mL或CFU/100mL)	不得检出
耐热大肠菌群(MPN/100mL或CFU/100mL)	不得检出
大肠埃希氏菌(MPN/100mL或CFU/100mL)	不得检出

MPN表示可能数；CFU表示菌落形成单位。当水样检出总大肠菌群时，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群；水样未检出总大肠菌群，不必检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。

四、检测流程图

接种于菌落 总数测试片

接种于大肠菌群检验纸片 或大肠菌群检测试剂盒

接种于致病菌检测 试剂盒

36℃±1℃培养15-24h

36℃±1℃培养15-24h

观察计数

报告

全部为 紫蓝色

纸片有黄色斑点 或试剂盒产酸产气

总大肠菌 群阴性

接种于耐热大肠菌 大肠埃希氏菌测试片

水样 ( 生活饮用水或水源水)

36℃±1℃培养18h

全部 澄清

一格或多 格混浊

阴性 结果

接种于对 应测试片

报告

44.5℃培养15-24h

报告

36℃培养 18h

有红色或 紫蓝色菌斑

有紫蓝 色菌斑

没有 菌斑

观察 结果

耐热大肠 菌群阳性

耐热大肠菌群和 大肠埃希氏菌阴性

埃希氏 菌阳性

报告

报告

报告

报告

五、菌落总数测试片使用说明

1 原理及适用范围：菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后所得1mL(g)检样或单位面积样品中所含菌落的总数，是常用的检测项目指标。菌落总数测试片(Aerobic Count Plates BB202)是一种预先制备好的一次性培养基产品，含有标准的营养培养基，冷水可溶性的吸水凝胶和脱氢酶指示剂——氯化三苯基四氮唑(TTC)，菌落在测试片上呈紫红色或粉红色，这样可缩短计数时间和增强计数效果。本产品适合于食品及水中菌落总数的测定，也可用于与食品接触的容器操作台和其他设备表面的卫生检测。

2 样品处理与稀释

2.1 生活饮用水：取充分混匀的水样(原液)检测。

2.2 水源水：以无菌操作方法吸取1mL充分混匀的水样，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀成1:10稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇后成为1:100的稀释液，以此类推，做出1:1000等稀释度的稀释液，每次换一支吸管。

2.3 食品：取样品 25 mL(g)放入含有225 mL灭菌生理盐水的取样罐或均质杯内，充分混匀成1:10稀释液。用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL，注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，振摇后成为1:100的稀释液，以此类推，做出1:1000等稀释度的稀释液，每次换一支吸管。

3 接种：将菌落总数测试片(BB202)置于实验台面，揭开上层膜准备接种。生活饮用水、纯水和矿泉水取原液，每个样品做两片；水源水以及食品选择2～3个稀释度进行检测，每个稀释度同时应做一平行接种。以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1mL混匀的样品液，慢慢均匀地滴加到测试片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置5 min使培养基凝固，用手轻轻地压一下。每次检测，同时将1mL灭菌生理盐水滴加到另一片测试片上作为空白对照。

4 培养： 将测试片叠在一起放回原自封袋中，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。培养温度为36℃±1℃，培养15～24h观察结果。

5 结果判读: 细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中(10～100个)的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升(克)样品中所含的细菌菌落总数。作菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各测试片菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时用。

6 计数原则及报告方式

6.1通常选择菌落在10～100个之间的测试片进行计数，乘以稀释倍数报告之(见表1实例1)。

6.2若有两个稀释度的菌落数在10～100个之内，两者的比值小于2，则取其平均数，若大于2，则用值小者(见表1实例2、例3)。

6.3若三个稀释度的菌落数都有在10～100个之内，应选择二个低数值的平均数(见表1实例4)。

6.4若三个稀释度的菌落数均小于10个或大于100个时，应重新试用更低或更高的稀释度进行菌落计数；或采用均小于数量标准的小值，或采用均大于数量标准的值(见表1实例5、例6)。

6.5若所有稀释度的测试片均无生长，以未检出报告之。菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采样两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示。

表1 稀释度选择及菌落总数报告方式

实例	稀释度			两稀释 度之比	选定计数 稀释度	报告方式 (个/g或 个/mL)
	10-1	10-2	10-3
1 2 3 4 5 6	158 208 265 98 8 295	76 68 82 50 5 174	5 12 50 15 1 106	— 1.8 6.1 — — —	10-2 10-2、10-3 10-2 10-1、10-2 10-1 10-3	7.6×103 9.4×103 8.2×103 3.0×103 8.0×10 1.1×105

7 表面取样方法：加1mL灭菌生理盐水在测试片上，静置至少1h使培养基凝固；提起上层膜，使中央滤纸部分贴到待测物表面，用手在外侧轻压；然后将上盖膜合上，置培养箱内培养。

六、饮用水大肠菌群检验纸片使用说明(五管法)

1 适用范围：适用于饮用水中总大肠菌群的快速检验。

2 方法原理：将乳糖、显色剂和选择性培养基加载在纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。

3操作方法

3.1用灭菌吸管吸取10mL水样插入装有大纸片的塑料薄膜袋中，均匀涂布，共做5个重复；

3.2将接种好的纸片平放于培养箱中，36℃±1℃，培养15～24h观察结果。

3.3观察每片颜色变化，若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为大肠菌群阳性。

3.4根据阳性反应纸片数，查MPN表得出水样中总大肠菌群的MPN值(见表2)。如所有纸片均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。

3.5 对于阳性纸片，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。用无菌镊子在阳性菌斑处挑取少许带菌滤纸，用3mL无菌水混匀，接种到大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片上，进行44.5℃培养和检验。

表2 用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的可能数(MPN)

阳性管或纸片数	总大肠菌群数(MPN/100mL)
0	0或﹤2.2
1	2.2
2	5.1
3	9.2
4	16.0
5	>16

七、水质大肠菌群检验纸片使用说明(十五管法)

1 适用范围：适用于水源水中总大肠菌群的快速检验。

2 方法原理：将乳糖、显色剂和选择性培养基加载在纸片上，经培养后能够在纸片上生长并发酵乳糖产酸的即为大肠菌群阳性，记录每个稀释度大肠菌群阳性纸片数，根据大肠菌群MPN表查出相应的大肠菌群数。

3操作方法

3.1 用灭菌吸管吸取10mL水样插入装有大纸片的塑料薄膜袋中，均匀涂布，共做5个重复；分别取1mL水样加到小纸片中，共接5个重复；另取1mL水样加到9mL无菌水中混匀，用1mL灭菌吸管分别吸取1mL(即0.1mL水样),加到5片小纸片中。

3.2将接种好的纸片平放于培养箱中，36℃±1℃，培养15～24h观察结果。

3.3 观察每片颜色变化，若纸片保持紫蓝色不变为大肠菌群阴性，纸片变黄或在黄色背景上呈现红色斑点或片状红晕为阳性。

3.4 根据每个稀释度的阳性反应纸片数，查MPN表(表3)可得出水样中总大肠菌群的MPN值。

3.5 对于阳性纸片，应进一步检验大肠埃希氏菌或耐热大肠菌群。用无菌镊子在阳性菌斑处挑取少许带菌滤纸，用3mL无菌水混匀，接种到大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片上，进行44.5℃培养和检验。

八、总大肠菌群检测试剂盒使用说明

1.适用范围：适用于二次供水、自来水、水源水、生活饮用水、矿泉水等样品中总大肠菌群检测。对污染较严重的样品采用十五管法，其它可采用五管检测法。

2.方法原理：与国标法相同。事先将乳糖蛋白胨培养基双料、乳糖蛋白胨培养基单料浓缩至试剂盒培养孔中，随时取用。

3.操作方法：

3.1十五管法：用无菌吸管吸取5个10mL水样分别加入到试剂盒1号～5号5个大发酵培养基孔内。吸取5个1mL水样分别加入到试剂盒7号～11号5个小发酵培养基孔内。吸取5个用灭菌生理盐水稀释后的1:10稀释液1mL加入到试剂盒12号～16号小发酵培养基孔内。余孔可做对照。

3.2 五管法: 用无菌吸管吸取5个10mL水样分别加入到试剂盒1号～5号5个大发酵培养基管(孔)内。余孔可做对照。

3.3 排气泡:加样后集气窗内如有气泡存在，可将试剂盒以30～45度角倾斜使气泡排出，必要时可轻轻用力在桌面上敲击数次排出气泡。

3.4 培养：将加样后的试剂盒置36℃± 1℃温箱中，培养18h～24h。

3.5 观察结果：样液变为黄色为产酸、集气窗中有气泡为产气，产酸产气者为阳性结果，可根据试剂盒的阳性管数,参照国标GB/T5750.12-2006的方法，查表 MPN检索表(表2或 表3)，报告每100mL水样中的总大肠菌群可能数。如需对阳性结果进一步证实，可参考GB/T5750.12-2006方法进行。如所有管数均为阴性时，可报告总大肠菌群未检出。

4. 注意事项：

4.1加入样品后不需摇匀，平拿平放。

4.2 加样时可用一次性无菌塑料吸管，将样品稀释液加至试剂盒所标刻度处。

4.3 在培养箱中取试剂盒时应平托出来，不要倾斜以免由于试剂盒的倾斜将阳性管集气窗中的气泡排出而影响结果。

4.4 试剂盒为一次性无菌用品，供一次性使用。

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B 微生物检测系列	大肠菌群快速检验纸片类	JL101	餐具大肠菌群快速检验纸片	100份/盒
		JL102	食品大肠菌群检验纸片	2份/包
		JL104	水质大肠菌群检验纸片	1份/包
		JL114	饮用水大肠菌群检验纸片	1份/包
	常规菌测试片类	JL211	大肠菌群测试片	24片/包
		JL202	菌落总数测试片	24片/包
		JL207	霉菌酵母菌测试片	24片/包
		JL203	大肠杆菌大肠菌群测试片(ECC)	24片/包
		JL213	大肠埃希氏菌耐热大肠菌群测试片	24片/包
	致病菌测试片类	JL204	大肠杆菌O157测试片	24片/包
		JL205	沙门氏菌测试片	24片/包
		JL206	金黄色葡萄球菌测试片	24片/包
		JL208	阪崎肠杆菌测试片	24片/包
		JL209	副溶血弧菌测试片	24片/包
		JL210	蜡样芽孢杆菌测试片	24片/包