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仅供科研使用
用途
美国FOCUS西尼罗河（West Nile）病毒IgG ELISA，利用了西尼罗重组抗原检测人体血清或血浆中的西尼罗抗体。本实验仅用于辅助诊断人感染了西尼罗病毒，不用于筛查血液或血液成分。仅供专业人员体外诊断使用。
概述
感染了西尼罗病毒会导致包括脑炎等一系列症状的疾病，西尼罗病毒在世界广泛传播，已在50多个国家检测出该病毒。本试验经CDC提供的试剂检验与验证。本试验使用了一种称为WNRA的重组抗原，它可以作为西尼罗病毒感染的快速血清学指标，WNRA蛋白是一种重组抗原，它是由含有西尼罗病毒两个抗原的序列多肽构成。
实验的原理
检测西尼罗病毒IgG ELISA 是基于两步夹心法原理制造的。
提供的材料
1. 微孔板（96孔 12x8）：即用 每孔均包被结合西尼罗重组抗原的单抗。2－8℃下保存至保质期。
注意：WNRA和NCA已包被于微孔板。
2. IgG样品稀释液：1支 25ml 即用 2-8℃下保存至使用。
3. IgG阴性质控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要长时间储存，将其分装于小瓶里，在-70℃下储存。
4. IgG阳性质控：1支 30ul 2-8℃下保存至使用。要长时间储存，将其分装于小瓶里，在-70℃下储存。
5. 洗涤液（10X）：1瓶 120ml 2－8℃下保存至使用。
6. EnWash：1瓶 20ml 2－8℃下保存至使用。
7. 酶联物：一瓶6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
8. TMB底物液： 1支 9ml 即用 2－8℃下保存至使用。
9. 终止液；1支6ml 即用 2－8℃下保存至使用。
试剂应避免反复冻融。
操作步骤
在使用前将所有试剂和样品平衡至室温，并轻轻倒转使其充分混匀。
实验准备：
将10X的浓缩洗涤液稀释,将120ml的浓缩洗涤液加上1080ml的蒸馏水，摇匀，至无任何沉淀，稀释好的洗涤液最多可在室温下放置两个星期。
准备实验所需的板条，剩余的板条应尽快放入袋子里重新密封，在2－8℃下储存至保质期。
操作步骤
1. 标记将要使用的板条，注意微孔板已经按照统一排列，如下所述包被西尼罗抗原和质控抗原。
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西尼罗抗原 |
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板条＃1 |
板条＃2 |
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A |
WNRA |
WNRA |
|
B |
WNRA |
WNRA |
|
C |
WNRA |
WNRA |
|
D |
WNRA |
WNRA |
|
E |
NCA |
NCA |
|
F |
NCA |
NCA |
|
G |
NCA |
NCA |
|
H |
NCA |
NCA |
2. 将血清样品﹑阴性质控和阳性质控同样地用样品稀释液按1：300稀释。
3. 每孔加入50ul稀释后的样品，以下为一个血清样品使用一个板条的典范。
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板条1 |
板条2 |
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血清样品 |
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A |
IgG N |
样品1 |
|
|
B |
IgG N |
样品1 |
|
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C |
IgG P |
样品2 |
|
|
D |
IgG P |
样品2 |
|
|
E |
IgG P |
样品2 |
|
|
F |
IgG P |
样品2 |
|
|
G |
IgG N |
样品1 |
|
|
H |
IgG N |
样品1 |
|
4. 封板，在湿润的温育器里37℃下温育1小时。
5. 温育后，用自动洗板机，使用洗涤液洗板6次。
6. 在每孔中加入50ul的酶联物。
7. 封板，在湿润的温育器里37℃下温育1小时。
8. 温育后，用自动洗板机，使用洗涤液洗板6次。
9. 每孔加入150ul的EnWash，在室温下温育5分钟
10. 温育后，用自动洗板机，使用洗涤液洗板6次。
11. 每孔加入75ul的TMB底物液。
12. 封板，在室温下，避光处温育10分钟。
13. 每孔加入50ul的终止液终止反应。
14. 在450nm处读取吸光率。
结果的计算
结果的变化将会非常大，以下结果仅供指引。
计算ISR值：
计算在同一实验里WNR抗原的两个阴性质控的平均值，计算同一实验里NC抗原的两个阴性质控的平均值，用WNRA/NCA，得出阴性质控的ISR值。同样地计算阳性质控和样品得ISR值，阳性质控的ISR值应高于3.0，阴性质控的ISR值应低于1.5。
|
ISR |
结果 |
解释 |
|
≤2.0 |
阴性 |
没有检测到IgG抗体 |
|
2.0－3.0 |
可疑 |
需确证实验 |
|
≥3.0 |
阳性 |
存在IgG抗体，建议做确定性实验 |
结果的判断：
在某些特殊的例子中，曾报道有假阳性，但对梅毒病人无限制。假如样品的ISR值大于2.0，但是WNRA和NCA的OD值均偏低，可视为潜在假阳性。以下为样品1排除标准的范例。
排除标准：
计算阴性质控的WNRA和NCA值：
|
WNRA |
NCA |
|
|
0.153 |
0.126 |
|
|
NO.2 |
0.125 |
0.110 |
|
总计 |
0.260 |
0.236 |
平均WNRA=0.260/2=0.130
NCA=0.236/2=0.118
ISR=0.130/0.118=1.10
任何阴性质控的ISR值高于1.5，则实验需要重做。
计算阳性质控的WNRA和NCA值：
|
WNRA |
NCA |
|
|
0.635 |
0.190 |
|
|
NO.2 |
0.655 |
0.178 |
|
总计 |
1.290 |
0.368 |
平均WNRA=1.290/2=0.645
NCA=0.368/2=0.184
ISR=0.645/0.184=3.5
任何阳性质控的ISR值低于3.0，则实验需要重做。
以下标准是必需遵守的，不满足以下标准，试剂出现了质量问题或操作错误，实验需重做。
|
因素 |
范围 |
|
平均阴性质控读数 |
＜0.400 |
|
平均阳性质控读数 |
＞0.400 |
|
阳性质控的ISR值 |
＞3.000 |
|
阴性质控的ISR值 |
＜1.500 |
解释结果
1. 样品的ISR值大于3.0视为阳性。
2. 阳性结果需重做证明。
3. 样品的ISR值小于2.0视为阴性。
4. 样品的ISR值小于3.0但是大于2.0，视为未确定，但是很有可能阳性，实验需一式三份重做。
5. ISR值大于2.0是因为WNRA和NCA的值都低造成的，应该视为潜在假阳性。
样品1低OD值的范例：
计算样品的WNRA和NCA值：
|
WNRA |
NCA |
|
|
0.044 |
0.190 |
|
|
NO.2 |
0.016 |
0.007 |
|
总计 |
0.060 |
0.026 |
平均WNRA=0.060/2=0.030
NCA=0.026/2=0.013
ISR=0.030/0.013=2.31
虽然样品的ISR值高于2.0，但是本样品需视为假阳性，因为其OD值低，而且远远偏离了相关的标准品，这通常在空白值高的情况下发生。
要进一步证实样品，所有阳性的结果都要用6，2层析稀释滴定法重做，与相同滴定法的阴性质控相比较，假如曲线是？？的，平的或者是波浪型的曲线，则表明为假阳性的结果。
实验的局限性
1. 样品的OD值高于抗原质控（非WNRA）,导致ISR值小于3.0，则可能为假阴性，再释稀样品重新实验，可能会获得真正的ISR值。
2. 既然这不是一个直接检测的方法，则需考虑假阳性和假阴性存在的可能性。
3. 所有有反应的样品，应用确定性实验来证实。
4. 本实验提供的试剂，尽可能地检测血清或血浆中的WNRA反应性抗体水平。
5. 应避免反复冻融样品和试剂。
6. 不要使用溶血或脂血的样品，它们会导致错误的结果。
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