使用说明书
【试剂盒简介】
猪圆环病毒PCR 检测试剂盒,采用聚合酶链反应(PCR )技术检测猪血清和组织中的PCV,适用于PCV的检测、诊断和流行病学调查。
【原理】
提取DNA作为模板,在DNA 聚合酶的作用下,经高温变性、低温退火和中温延伸的多次循环,使特异DNA 片段的拷贝数放大数百万倍。将扩增的DNA 片段进行电泳、染色后,在紫外灯下,肉眼可见DNA 片段的扩增带。
【试剂盒组份】
1. 裂解液 |
8mL |
8. 阳性对照 |
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2. 蛋白酶K |
110μL |
9. 0.2 mL 薄壁PCR 管 |
15个 |
3. 抽提液 |
8mL |
10. PCR 反应液A |
180μL |
4. 异丙醇 |
7mL |
11. PCR 反应液B |
50μL |
5. 洗涤液 |
12mL |
12. 50 倍TAE 电泳缓冲液 |
20mL |
6. 无菌水 |
500μL |
13. 染色液 |
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7. 阴性对照 |
300μL |
10μL |
注:塑料袋内试剂(阳性对照、蛋白酶K、PCR反应液A和B)-20 ℃冻存,其他室温保存。
【操作方法】
一、样品制备
1样品采集:病死或扑杀的猪,取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、扁桃体、淋巴结等组织;待检活猪,用棉拭子取鼻腔分泌物,置于50%甘油生理盐水中,或用注射器取血5 mL,2~8 ℃保存。(要求送检病料新鲜,严禁反复冻融。)
2样品处理:
2.1 组织样品的处理:称取组织0.1g于研磨器中磨碎,再加1mL生理盐水继续磨至无块状物;然后将样品转至1.5 mL灭菌离心管中,8000 rpm离心5 min,取上清100 µL,加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
2.2 全血样品的处理:待血凝后取血清放于离心管中,8000 rpm离心5 min,取上清100 µL,加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
2.3 阳性对照的处理: 混匀后取100 µL,加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
2.4 阴性对照的处理: 混匀后取100 µL,加入500 µL裂解液和10 µL蛋白酶K,混匀后37℃温育1h。
二、病毒DNA的提取
1. 取已处理的样品、阴性对照和阳性对照,分别加入600µL抽提液(用抽提液之前不要晃动,不要吸到上层保护液),用力颠倒10次混匀,12,000 rpm 离心10min。
2. 取500µL上清置于灭菌离心管中,加入500µL异丙醇,混匀,置液氮中3min或-70℃冰箱中30min。取出样品管,室温融化,13,000 rpm 离心15min。
3. 弃上清,沿管壁缓缓加入1mL 洗涤液,轻轻旋转一周后倒掉,将离心管倒扣于吸水纸上1min,再将离心管真空抽干15min或37℃烘干。
4. 用30µL无菌水溶解沉淀,作为模板备用。
三、PCR
1. 反应体系:分别取16µL PCR反应液A(用前混匀)、2µL PCR反应液B(用前混匀)和2µL模板DNA,混匀。
2. 反应程序:在PCR仪上运行以下程序: 94 ℃ 3 min ;94 ℃ 30 s 、55℃ 30 s 、72 ℃ 30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。
四、电泳
1. 制胶:用50倍稀释的TAE电泳缓冲液配制1%琼脂糖凝胶。
2. 电泳:待胶凝固后,取5µL PCR扩增产物点样于琼脂糖凝胶孔中,以5V/cm的电压于50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液中电泳。
3. 染色:取50 倍稀释的TAE 电泳缓冲液30mL,加入10µL染色液,混匀后将胶浸泡30min,于紫外灯下观察结果。
【结果判断】
阳性对照出现400bp扩增带,阴性对照无带出现(引物带除外)时,实验结果成立。被检样品出现400bp扩增带为猪伪狂犬病毒阳性,否则为阴性。
【需用但未提供的材料】
组织研磨器、眼科剪、眼科镊、一次性注射器、琼脂糖、灭菌1.5mL 离心管和吸头(10 µL、200 µL、1000 µL)。
【注意事项】
1.本试剂盒有效期为6个月,不要使用超过有效期限的试剂,试剂盒之间的组分不要混用。
2.所有试剂应在规定的温度储存,使用时拿到室温下,使用后立即放回。
3.注意防止试剂盒组分受污染。使用前将塑料袋内试剂瞬离15s,使液体全部沉于管底,放于冰盒中,吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。
4.严格按试剂盒说明书操作可以获得的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。
5.所有接触病料的物品均应合理处理,以免污染实验室。
【生产企业】 广州健仑生物科技有限公司
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