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使用说明书
一. 概要
孔雀石绿是一种带有金属光泽的绿色结晶体，又名碱性绿、盐基块绿、孔雀绿，其既是杀真菌剂，又是染料，易溶于水，溶液呈蓝绿色。长期以来，渔民都用它来预防鱼的水霉病、鳃霉病、小瓜虫病等，而且为了使鳞受损的鱼延长生命，在运输过程中和存放池内，也常使用孔雀石绿。研究显示，孔雀石绿在鱼体内残留时间长，且具有高毒性、高残留和致癌、致畸、致突变等副作用，鉴于此，许多国家均将孔雀石绿列为水产养殖禁用药物。我国于2002年5月也将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》中。目前检测孔雀石绿的方法有两种：HPLC或GC-MS，但是其前处理步骤繁琐，费用昂贵。本试剂盒采用竞争酶标免疫法，同时把隐性孔雀石绿氧化成孔雀石绿，可经济、快速地检测鱼、虾、以及鱼池或者鱼缸水样中的总的孔雀石绿残留。
二. 测定原理
孔雀石绿酶联免疫检测试剂盒是利用免疫学竞争法的原理，固相载体微孔板上包被有孔雀石绿蛋白偶联物。检测时，加入待测孔雀石绿标准品或样品溶液，然后加入特异性的孔雀石绿的抗体一起孵育，溶液中的孔雀石绿跟板上包被的孔雀石绿蛋白偶联物竞争性地与孔雀石绿抗体结合，形成抗原抗体复合物。孵育一段时间后，洗板，加入羊抗鼠辣根过氧化物酶结合物；洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿的浓度与吸收光强度成反比。
三. 试剂盒组成
（1）96孔酶标板：1块（孔雀石绿蛋白偶联物）
（2）标准品贮备液（0.5ml/瓶）：81ppm
（3）标准品稀释液……………………20ml
（4）10×浓缩抗体……………………0.8ml
（5）10×浓缩酶结合物………………1.6ml
（6）显色剂A …………………………7ml
（7）显色剂B …………………………7ml
（8）终止液 …………………………7ml
（9）10×浓缩洗涤液…………………50ml
（10）样本稀释缓冲液…………………4ml
（11）5×浓缩提取液A………………50ml
（12）2×浓缩提取液B………………20ml
（13）中性柱层析氧化铝，100-200目，1瓶
（14）氧化液…………………………2ml
（15）活化剂…………………………1ml
（16）使用说明书
四．需要但试剂盒中不提供的器材和试剂
（1）设备
…微孔板酶标仪(450nm)
…均质器
…振荡器
…离心机
…20μl,200μl,1000μl微量移液器
…5ml,10ml移液管或10ml注射器
…15ml塑料离心管
…氮吹仪或旋转蒸发仪
（2）试剂
…二氯甲烷（分析纯）
…乙腈（分析纯）
…无水硫酸钠（分析纯）
…正己烷（分析纯）
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都须注意：
（1）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（2）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1：提取液A
用蒸馏水将5×浓缩提取液A，按1：4体积比进行稀释（即1ml 5×浓缩提取液A +4ml蒸馏水），40C保存。
配液2：提取液B
用蒸馏水将2×浓缩提取液B，按1：1体积比进行稀释（即1ml 2×浓缩提取液B +1ml蒸馏水）。
样本处理步骤：
1、鱼/虾样品的准备（稀释倍数3）
a) 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品;
b) 称取1g均质好的样品，放入15ml离心管中，加入2ml提取液A(即配液1)涡旋30秒，加入4ml乙腈，用振荡器剧烈振荡5分钟，4000转／分离心 5分钟，把上清倒入15ml离心管中。
c)加入4mL正己烷，在振荡器上剧烈振荡2分钟，静置或4000转/分离心3分钟分层，去掉上层正己烷层(可用一个10ml注射器吸去大部分正己烷,然后用1ml移液器把正己烷层去完全)
d)向该溶液加0.4ml提取液B(即配液2)和2ml二氯甲烷，用振荡器振荡5分钟，4000转／分离心3分钟，移去下面的水层(水层是量少的那层,可以用一个10ml注射器接一软管吸去底层的水层)。 在余下的液体中加入0.8克的无水硫酸钠，不时振荡混合，放置 5分钟。移取液体层, 在50℃下，用氮气吹干或旋转蒸发仪蒸干。
e)加入0.265ml乙腈，在涡旋仪上充分涡旋5分钟，加入35μl氧化液，涡旋2分钟，放置15分钟，加入100mg
中性层析氧化铝，充分涡旋5分钟（此时乙腈层可以取出40C保存, 以避免乙腈层挥发干）；
f) 测定时取上层乙腈溶液25μl，加50μl样本稀释缓冲液，175μl蒸馏水，混合均匀，取50μl作ELISA分析。
2、水质样品（稀释倍数1.43）
取水样175μl, 加入50μl样本稀释缓冲液, 25μl乙腈，取50μl作ELISA分析。
六、酶联免疫测定程序
测定前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用微孔板回升至室温。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在使用中不要让微孔干燥。
4、在ELISA分析中的重复性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
5、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
测定步骤：
1、 将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min以上，每种液体使用前均须摇匀。注意标准液均需做2个平行试验。
2、 配液A：6个不同浓度的标准液（现用现配）
取8个1.5ml离心管,标为1到8号,分别加入495,495, 600, 400, 400, 400, 400, 400μl标准品稀释液, 按照下表配制标准品.如 5μl标准品贮备液加入1号管与495μl标准品稀释液混匀，制备成810ng/ml孔雀石绿标准液。取5μl 配好的810ng/ml孔雀石绿标准液, 加入2号管, 与495μl标准品稀释液混匀，制备成8.1ng/ml孔雀石绿标准液。取200μl 配好的8.1ng/ml孔雀石绿标准液, 加入3号管, 与600μl标准品稀释液混匀，制备成2.025ng/ml孔雀石绿标准液。依次稀释，制备成2.025、0.675、0.225、0.075、0.025、0ng/ml的标准液（见下表）。标准液现配现用。
取8个1.5ml离心管编为1，2，3，4，5，6，7，8
|
管号 |
标准品稀释液 (μl) |
|
孔雀石绿标准液浓度（ng/ml） |
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1 |
495 |
5μl标准品贮备液 |
810 |
|
2 |
495 |
5μl 1号液 |
8.1 |
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3 |
600 |
200μl 2号液 |
2.025 |
|
4 |
400 |
200μl 3号液 |
0.675 |
|
5 |
400 |
200μl 4号液 |
0.225 |
|
6 |
400 |
200μl 5号液 |
0.075 |
|
7 |
400 |
200μl 6号液 |
0.025 |
|
8 |
400 |
|
0 |
配液B：活化剂工作液
用蒸馏水将活化剂按1：99体积比进行稀释（即1ml 活化剂 +99ml蒸馏水）【按需配制】
配液C：将50ml浓缩洗涤液（10倍浓缩）用蒸馏水稀
释至500ml备用。（可按需配置）
配液D：用配液C将10×浓缩抗体稀释10倍（即取1ml
10×浓缩抗体+9ml配液C）(临用时按需配置)
配液E：用配液C将10×浓缩酶结合物稀释10倍（即取1m10×浓缩酶结合物+9ml配液C）(临用时按需配置)
3、 加120ul活化剂工作液（即配液B）到微孔板中，室温下反应10分钟后倒掉拍干，每孔注满洗涤工作液（即配液C），轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复洗涤3次或机洗4次
4、加标准液或样品液50μl到相应的微孔中，然后加50μl抗体工作液(即配液D)，用膜盖好，37℃下避光反应30分钟。
5、小心揭开盖板膜，弃去孔中液体，并将微孔板剩余残液在吸水纸上拍干。每孔注满洗涤工作液（即配液C），轻轻振荡，放置2分钟，弃去孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复洗涤4次或机洗5次。
6、加100μl酶结合物工作液（即配液E）到微孔板中，用膜盖好，37℃下避光反应30分钟。取出重复步骤5
7、显色剂A和B以1：1充分混合后，加100μl到微孔中，并在37℃下避光反应15分钟。
8、加50μl终止液到微孔板中，在酶标仪于450nm处测定OD值。
七、结果
所测得的标准液和样品吸光度的平均值除以个标准液（0标准液）的吸光度值再乘以100，得到百分吸光度值。0标准液的百分吸光度值等于。
标准液的吸光度值（或样品）
-----------------------------------×100 = %吸光度值
0标准液的吸光度值
以标准品浓度的以10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含孔雀石绿的量。
八、检测方法灵敏度、准确度、精密度
试剂盒灵敏度：0.025ppb
样本检测限：
鱼/虾等水产品 ………………………0.5ppb
水样 …………………………………0.1 ppb
准确度：
水样/鱼/虾等水产品…………………80±15%
精密度：
试剂盒的变异系数均小于10%
九、特异性
与类似物的交叉反应率：
孔雀石绿 ………………………
结晶紫 ……………………… 91%
隐性孔雀石绿 ………………… 0.4%
隐性结晶紫 …………………＜0.01%
十、注意事项
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准
曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应
立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需要将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。如不慎滴漏到皮肤上，请尽快用水冲洗。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效
期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂
盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒
中的试剂。
6、储存条件
保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象
显色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450nm）值小于0.6（A450nm<0.6 ）时，表示试剂可能变质。
8、在加入显色剂后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
9、该试剂盒反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
十一、贮藏条件及保存期
贮藏条件：在2～8℃保存试剂盒
保存期：本试剂盒有效期为12个月。
