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【用途】
用来检测鸡血清中的禽呼肠孤病毒抗体
【试验原理】
禽呼肠孤病毒被认为与病毒性关节炎、发育迟缓综合征、呼吸系统疾病、肠热病、吸收障碍综合症和骨质疏松有关，从未发病的鸡中也可分离到呼肠孤病毒，根据宿主日龄、毒力和接触病毒途径的不同，病毒诱发疾病的的性质、症状和严重程度也不同，鸡血清中的禽呼肠孤病毒抗体水平及整个鸡群的免疫状况可用ELISA方法进行监测。
将灭活的抗原包被在微孔板上，加入稀释后的血清并孵育。血清中的所有抗REO抗体将与微孔板上的REO抗原结合并形成REO抗原-抗体复合物，然后洗掉未结合的物质，加入碱性磷酸酶标记的抗鸡的IgG（结合物）至微孔板中，结合物将与REO抗原-抗体复合物结合，孵育后洗掉未结合的结合物，加入底物溶液。底物与碱性磷酸酶发生反应形成黄色的物质。，终止反应，将颜色固定。颜色的深浅可用酶标仪（405-410nm）测定。
【一个微孔板所需的试剂的量】
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抗原包被微孔板
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12×8条（板）
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样品稀释液（1×）
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120ml |
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洗涤液（1×）
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500ml |
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阳性对照
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2μl |
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阴性对照
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2μl |
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结合物
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12ml |
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底物液
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12ml |
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终止液
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12ml |
【所需物品】
1. 能够吸取2μl、100μl和800μl的精确移液器
2. 吸取100μl的多通道移液器
3. 计时器
4. 量筒
5. 蒸馏水
6. 洗板机
7. 稀释用容器
8. 能够读双波（405-410nm和630-650nm）的酶标仪，OD值读数可达到3.0
【样品收集】
采集至少0.5ml全血，分离血清并放在冰箱里，2-7℃用于短期储存，如果长期储存，应冷冻，且避免反复冻溶。如果样品含有可见的颗粒物质，应在检测之前将其离心除去，严重污染的样品不允许使用（如高度浑浊、细菌污染等）
【结果计算】
将阳性对照吸光度值和样品吸光度值分别减去阴性对照吸光度值，注意：对照品及样品吸光度值都应该是2个重复孔的平均值。每个样品的计算式如下：
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样品平均吸光度值 － 阴性对照吸平均吸光度值
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＝样品与阳性对照比值（Sp）
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阳性对照平均吸光度值 － 阴性对照平均吸光度值
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Sp ×（100）＝ ELISA Unit (EU) 阳性对照值设为100 EU
【结果判定及EU单位说明】
REO ELISA 值 说明
小于10EUs REO抗体为阴性
10-25 EUs REO抗体为弱阳性，应被认为经过免疫或暴露于REO，油乳状疫苗也可能引起非特异性低水平抗体。
25-75 EUs REO抗体适度阳性
＞75 EUs REO抗体强阳性
【操作步骤】
1. 将试剂回温至室温，通过颠倒和涡旋将试剂混匀。
2. 将1份4×样品稀释液加入到含3份去离子水的容器中，充分混匀，例如，30ml 4×样品稀释液加入到90ml去离子水中。
3. 将1份20×洗涤液加入到含19份去离子水的容器中，充分混匀，例如，25ml 20×洗涤液加入到475ml去离子水中。
4. 稀释前将阳性对照、阴性对照和样品震荡均匀。
5. 阳性对照、阴性对照和样品均需要用样品稀释液稀释后使用。稀释比例为2μl ：800μl。将移液器调到100μl，反复吹打4次使之充分混匀。
6. 将稀释后的阴性对照、阳性对照分别加入微孔中，每种做两个平行，每孔100μl；将稀释后的样品100μl分别加入孔中，室温下静置30分钟。
7. 弃去微孔板中溶液，每孔加入300μl洗涤液洗涤，重复洗涤2次，在洗涤过程中防止酶标板变干。
8. 每孔立即加入100μl结合物，室温静置30分钟。
9. 重复步骤7进行洗板。
10. 每孔立即加入100μl底物，室温静置30分钟。
11. 不要倒掉板内液体，每孔立即加入100μl终止液。
12. 用酶标仪双波读数（405nm或410nm作为主要波长，630nm或650nm为参考波长），计算结果。
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