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无内毒素质粒大提试剂盒
EndoFree Plasmid Maxi Kit
（产品咨询：13570344479/QQ712628583）
简介：
纯化得到至多500 μg无内毒素高转染级纯质粒或柯斯质粒DNA
1.纯化得到的DNA内毒素低于0.1 EU/?g
2.纯化流程快，同时去除内毒素
3.获得高产量的高拷贝质粒DNA
4.使用LyseBlue，获得的裂解和高产量的DNA
EndoFree Plasmid Kits基于阴离子交换技术，可快速制备不含内毒素的质粒DNA。QIAfilter Cartridges通过过滤快速澄清裂解液，DNA产量至多500 μg（Maxi）、2.5 mg（Mega）和10 mg（Giga）。制备的DNA纯度超过两次CsCl梯度离心法所得DNA的纯度，非常适合超转染级纯的应用。
详细信息：
性能
EndoFree Plasmid Maxi Kit将高效的内毒素去除步骤整合到质粒纯化过程中，不需要额外步骤，也不需用亲和柱去除脂多糖。通过QIAfilter Maxi Cartridge过滤细菌裂解液，通过重力流QIAGEN-tip 500阴离子交换柱纯化质粒DNA。100–250 ml培养菌液至多可纯化500 ?g DNA。（培养量取决于质粒拷贝数量、插入片段大小、宿主菌和培养介质。）纯化的DNA无内毒素（<0.1 EU/?g DNA）。
EndoFree Plasmid Kits去除细菌在裂解过程中释放的内毒素，内毒素会影响原代细胞和敏感培养细胞的DNA转染。从EndoFree Plasmid Kits得到的无内毒素DNA高度适用于可重复且结果可靠的转染。QIAGEN超纯无内毒素DNA也适用于基因治疗研究和其他敏感应用。
质粒制备中的内毒素水平*
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质粒准备方法 |
内毒素(EU?/?g DNA) |
平均转染效率? |
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EndoFree Plasmid Kit |
0.1 |
154% |
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QIAGEN Plasmid Kit |
9.3 |
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2x CsCl |
2.6 |
99% |
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Silica-gel slurry |
1230.0 |
24% |
* 宿主菌：大肠杆菌DH5α 质粒：pRSVcat.
? 1 ng LPS = 1.8 EU.
? 根据表中数据计算 Plasmid purificationmethod versus transfection efficiency.
无内毒素DNA配合原代细胞得到高转染率*
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DNA纯化方法 |
转染细胞百分比 |
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EndoFree Plasmid Kit |
21.0% ± 0.93 |
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QIAGEN Plasmid Kit |
8.1% ± 0.57 |
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Silica-gel slurry |
5.2% ± 0.74 |
* 原代兔胃壁细胞转染pEGFP-N2（CLONTECH），pEGFP-N2由所示的方法制备。使用EffecteneTransfection Reagent进行转染。该数据是细胞表达GFP的百分率，由转染48小时后绿色荧光细胞数量确定。转染效率是每种纯化方法制备的超过2个不同的DNA中6–9个复制样本的平均值。（数据由C. Chew andJ. Parente友情提供， Department ofMolecular Medicine and Genetics, MedicalCollege of Georgia, Augusta, Georgia,USA.）
原理
纯化的质粒DNA内毒素污染水平取决于所用的纯化方法（参见"Endotoxin levels in plasmidpreparations"）。硅胶技术纯化的DNA具有非常高的内毒素水平。QIAGEN、QIAfilter、HiSpeed Plasmid Kits和两次CsCl超速离心可获得相对低水平内毒素的纯DNA。EndoFree Plasmid Buffer Set包含完整的内毒素去除步骤，获得<0.1 EU/?g的质粒DNA。
QIAfilter、HiSpeed和EndoFree Plasmid Kits提供的QIAfilter Cartridges是特殊设计的过滤装置，用于代替细菌细胞碱裂解后的离心步骤。QIAfilter Cartridges可完全去除SDS沉淀，清除细菌裂解液，相比离心可大量节约时间，减少1小时的质粒纯化时间。QIAfilter Maxi Cartridges在几秒钟内，推动液体通过过滤器，以注射的方式将裂解物清除。
QIAGEN-tips中的阴离子交换树脂（不提供EndoFree Plasmid Buffer Set）专为核酸纯化而开发。它的分离性能使得DNA纯度与连续两次CsCl梯度离心获得的DNA纯度相当。由重力流驱动并持续运转的预装QIAGEN-tips，限度减少手动制备质粒所需的时间。整个QIAGEN质粒纯化系统不使用有毒物质，如苯酚，氯仿，溴化乙锭和CsCl，限度地减少对用户和环境的危害。
内毒素，又称脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌细胞膜的组成部分，如大肠杆菌。内毒素在质粒解裂纯化过程中释放，并显著地降低内毒素敏感的细胞株转染效率。此外，内毒素与DNA竞争“自由”转染试剂，影响转染实验。内毒素也诱导巨噬细胞和B细胞等免疫细胞中非特异性免疫反应，从而导致转染结果的误读。这些反应包括诱导的蛋白质和脂类，如IL-1和前列腺素的合成。总体而言，内毒素在转染实验装置中是不可控变量，影响结果的可重复性，使它们难以对比、解读。在基因治疗研究中，内毒素可造成内毒素休克综合症和激活补体级联，干扰研究。
操作流程（广州健仑生物科技有限公司，13570344479）
在碱性条件下，细菌细胞裂解，用QIAfilter Cartridge清除粗裂解物。将Endotoxin Removal Buffer加入到过滤后的裂解液中。冰浴后，将纯净的裂解物上样到阴离子交换柱上，在适当的低盐和pH条件下，质粒DNA选择性结合。用中盐缓冲液清除RNA、蛋白质、代谢产物和其他低分子量杂质，超纯质粒DNA被高盐缓冲液洗脱（参见QIAGEN Plasmid Kit procedures）。DNA由异丙醇脱盐、沉淀并且离心回收。
应用
使用EndoFree Plasmid Kits纯化的DNA适合多种敏感应用，包括：
1.转染，包括原代、敏感以及悬浮细胞
2.基因治疗研究
3.基因沉默
4.显微注射
技术参数：
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特点 |
参数 |
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Applications |
Transfection, gene therapy |
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Culture volume/starting material |
100 ?l – 250 ml culture volume |
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Plasmid type |
High-copy, low-copy, cosmid DNA |
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Processing |
Manual (vacuum) |
|
Samples per run; throughput |
1 sample per run |
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Technology |
Anion-exchange technology |
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Time per run or prep per run |
150 min |
|
Yield |
<500 ?g |
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